蘭花育種方法

育種方法及其實驗技術
基因轉型
1. Electroporation 電穿孔法
高壓脈衝下，細胞膜出現短暫、可逆性的開放小孔，可導入外源DNA分子，應用於植物原生質體、植物細胞。
　優點：可迅速有效地轉基因，適用於瞬時表現的研究
　缺點：電激儀價錢昂貴，且電穿孔法依賴原生質體的培養、再生，在應用方面上有一定的侷限性。
　*以裸露的原生質體做為受體材料，必須在建立可靠高效率的原生質體再生系
　 統的前提下應用，但許多禾穀類作物，其原生質體培養及再生很困難，轉型頻率低。


2. PEG介導
在二價陽離子(Mg2+、Ca2+)的存在下，PEG(聚乙二醇)與DNA分子形成共沉澱，接著被原生質體吸收。
　優點：實驗成本低廉，結果較穩定，不形成嵌合體，有較好的重複性，且不需要特別的儀器。
　缺點：也是以原生質體作為材料，應用範圍受到很大的限制。

3. liposome介導
將外源DNA包裝於脂質中，透過liposome與原生質體的共保溫培養，可使兩者的脂膜動態結合，外源DNA便釋放入原生質體中。
　優點：1987年，美國科學家合成了lipofectin，轉型水稻提高了轉型頻率，由於有商品出售，簡化了實驗程序。
　缺點：以原生質體作為受體材料。



　*上述三項方法皆以原生質體作為受體材料

優點：植物細胞原生質體可以再生出完整植株，因而去掉了細胞壁，消除了DNA轉型的大障礙，此外可大量操作，也打破了Agrobacterium的宿主範圍限制。
缺點：植物原生質體的分離與培養難度較大，尤其以禾本科為最。另外，過較長時期的細胞培養，遺傳背景可發生變化，以不育為最。



4. Agrobacterium
以農稈菌為載體，將外源基因置於Ti plasmid中，當農稈菌成染植物細胞此段基因可轉移到植物的基因組裡，並穩定地遺傳給後代。
　優點：a. 是自然界中天然發生的完美的基因轉型
　　　　b. 成功率高，效果好，方法也是最成熟的，應用廣
　　　　c. 可容許相當大的DNA片段插入，大於等於50kb
　　　　d. T-DNA上含有引導DNA轉移，整合的序列，及能被高等植物細胞識別的promoter、translation signal
　　　　e. 接入的外源基因可依不同的需要，連接司的promoter
　　　　f. 此種方式，外源基因多以one copy插入，遺傳穩定性好。
　缺點：農稈菌侵染的寄主，主要限於雙子葉植物，加上一些少數單子葉植物，大多數單子葉植物，包括重要禾穀類作物，對農稈菌不敏感，限制了應用範圍

5. Gene Gun
質體DNA先沉澱在微彈(金屬粒子，例如：鎢粉、金粉)表面，利用火藥爆炸，高壓放電或高壓氣體作為驅動力，加速金屬粒子，使其進入植物細胞，隨後釋放出DNA分子，隨機整合到植物的基因組內。
　優點：易於重覆，沒有基因型的依賴性，在禾穀類作物中得到廣泛的應用。
　缺點：a. 此種轉型方法，外源DNA插入genome是隨機的，於是產生了定點整合的問題，有待解決。
　　　　b. 插入位置不同，可能影響到外源DNA的表現，或原株性狀突變。