蘭花育種方法

育種方法及其實驗技術
基因轉型
1. Electroporation 電穿孔法
高壓脈衝下,細胞膜出現短暫、可逆性的開放小孔,可導入外源DNA分子,應用於植物原生質體、植物細胞。
 優點:可迅速有效地轉基因,適用於瞬時表現的研究
 缺點:電激儀價錢昂貴,且電穿孔法依賴原生質體的培養、再生,在應用方面上有一定的侷限性。
 *以裸露的原生質體做為受體材料,必須在建立可靠高效率的原生質體再生系
  統的前提下應用,但許多禾穀類作物,其原生質體培養及再生很困難,轉型頻率低。


2. PEG介導
在二價陽離子(Mg2+、Ca2+)的存在下,PEG(聚乙二醇)與DNA分子形成共沉澱,接著被原生質體吸收。
 優點:實驗成本低廉,結果較穩定,不形成嵌合體,有較好的重複性,且不需要特別的儀器。
 缺點:也是以原生質體作為材料,應用範圍受到很大的限制。

3. liposome介導
將外源DNA包裝於脂質中,透過liposome與原生質體的共保溫培養,可使兩者的脂膜動態結合,外源DNA便釋放入原生質體中。
 優點:1987年,美國科學家合成了lipofectin,轉型水稻提高了轉型頻率,由於有商品出售,簡化了實驗程序。
 缺點:以原生質體作為受體材料。



 *上述三項方法皆以原生質體作為受體材料

優點:植物細胞原生質體可以再生出完整植株,因而去掉了細胞壁,消除了DNA轉型的大障礙,此外可大量操作,也打破了Agrobacterium的宿主範圍限制。
缺點:植物原生質體的分離與培養難度較大,尤其以禾本科為最。另外,過較長時期的細胞培養,遺傳背景可發生變化,以不育為最。



4. Agrobacterium
以農稈菌為載體,將外源基因置於Ti plasmid中,當農稈菌成染植物細胞此段基因可轉移到植物的基因組裡,並穩定地遺傳給後代。
 優點:a. 是自然界中天然發生的完美的基因轉型
    b. 成功率高,效果好,方法也是最成熟的,應用廣
    c. 可容許相當大的DNA片段插入,大於等於50kb
    d. T-DNA上含有引導DNA轉移,整合的序列,及能被高等植物細胞識別的promoter、translation signal
    e. 接入的外源基因可依不同的需要,連接司的promoter
    f. 此種方式,外源基因多以one copy插入,遺傳穩定性好。
 缺點:農稈菌侵染的寄主,主要限於雙子葉植物,加上一些少數單子葉植物,大多數單子葉植物,包括重要禾穀類作物,對農稈菌不敏感,限制了應用範圍

5. Gene Gun
質體DNA先沉澱在微彈(金屬粒子,例如:鎢粉、金粉)表面,利用火藥爆炸,高壓放電或高壓氣體作為驅動力,加速金屬粒子,使其進入植物細胞,隨後釋放出DNA分子,隨機整合到植物的基因組內。
 優點:易於重覆,沒有基因型的依賴性,在禾穀類作物中得到廣泛的應用。
 缺點:a. 此種轉型方法,外源DNA插入genome是隨機的,於是產生了定點整合的問題,有待解決。
    b. 插入位置不同,可能影響到外源DNA的表現,或原株性狀突變。

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